用于水生病原菌的3种高通量活菌计数方法的比较

以一株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)作为研究对象,比较了MTT [3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐]比色法、ATP生物发光法和高通量生长曲线法在活细菌高通量计数上的应用效果。用96孔培养板进行不同浓度细菌活菌计数,确定了上述3种方法在副溶血弧菌活菌计数的标准曲线和线性范围。结果显示,副溶血弧菌的MTT比色法以DMSO溶解的MTT产物甲瓒在555 nm的吸光度(OD555 nm)为计数依据,活菌数的对数(LgC)与LgOD555 nm线性关系的标准曲线为LgC=(1.0439±0.0200)LgOD555 nm+(8.0565±0.0125),相关系数R²=0.9965,线性检测范围为7.8×106~2.5×108 CFU/ml;ATP生物发光法以ATP产生的相对发光度值(RLU)为计数依据,LgC与LgRUL线性关系的标准曲线为LgC=(0.9590±0.0065)LgRLU+(0.9949±0.0366),相关系数R²=0.9994,线性检测范围为1.0×104~3.0×108 CFU/ml;高通量生长曲线法以生长曲线达到拐点的时间(Ts)为计数依据,LgC与Ts线性关系的标准曲线为LgC=?(0.8727±0.0230)Ts+(9.0128±0.1572),相关系数R²=0.9924,线性检测范围为1.0×100~1.0×107 CFU/ml。用3种方法对实际菌液测量并与平板计数法比较表明,ATP生物发光法与高通量生长曲线法有很好的准确性,MTT比色法准确度稍差,而高通量生长曲线法有最宽的线性范围,也最适合高通量测定。     

一株感染深水网箱养殖许氏平鲉的病原菌分离与鉴定

2016年7月,山东省长岛县深水网箱养殖许氏平鲉(Sebastes schlegeli)暴发严重皮肤溃疡症。作者对病鱼进行病原菌分离。通过形态学观察、常规生理生化试验、gyrB和16S rDNA基因克隆测序等方法对分离菌株进行鉴定。在病灶溃疡处分离到一株绝对优势菌BZ01,该菌株在TSB固体培养基上呈半透明菌落,在TCBS选择性培养基上菌落呈绿色。透射电镜观察为短棒状,具有单根极生鞭毛。人工回接感染证明,该菌株对许氏平鲉具有较强的致病力,可以引起皮肤溃疡等症状,且与自然感染症状一致,其LD₅₀为2.07×10~6 CFU/ml。通过gyrB和16S rDNA基因序列测定并构建系统发育树显示,菌株BZ01与弧菌属同源性最高,并在系统发育树中与轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)聚为一枝,结合形态及生理生化表型测定结果,将该菌株鉴定为轮虫弧菌(V.rotiferianus)。药敏试验结果显示,该菌株对四环素类、喹诺酮类、香豆素类、肽酰转移酶类高度敏感,而对大环内酯类、多肽类、磺胺类、β-内酰胺类、氨基糖苷类中度敏感或不敏感。     

基于TaqMan qPCR检测凡纳滨对虾样品中虾肝肠胞虫并样检测方法的评价

对山东海阳和潍坊的2个养殖凡纳滨对虾群体取样,采用TaqMan qPCR逐尾检测肝胰腺中的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)载量,再将提取的DNA样品按5并1(5∶1)、25并1(25∶1)、50并1(50∶1)、100并1(100∶1)和150并1(150∶1)进行并样,检测并样的EHP载量。设定不同临界循环数为假定灵敏度,定性判断各单尾检测阳性及并样组阳性,比较不同并样模式与检测阳性率、诊断灵敏度、诊断特异性等之间的关系以及定量的准确性。结果表明,检测灵敏度过低,会降低高并样率检测的准确性;阳性率在30%以上时,高并样率的检测结果与单样品检测相符性很好;高载量感染的阳性率不低于6.7%时,50∶1以内的并样能准确得出检测结果;低载量感染的阳性率不低于16%时,25∶1以内的并样能得出较好结果;高载量感染的1.3%阳性率和低载量感染的8%阳性率可能导致所有并样出现假阴性结果;各种并样模式均有很好的诊断特异性,50∶1并样的诊断灵敏度与OIE标准推荐的5∶1并样的接近;各并样检测的EHP载量与单样品检测平均值之比在0.27~2.83范围,二者存在极显著相关性,各种并样模式的定量检测结果在数量级水平能大致反映样品的平均EHP载量。本研究为水生动物疫病诊断和流行病学调查的样品检测提供了参考依据。     

桑沟湾养殖海带生长的模型预测

海带(Saccharinajaponica)是一种常见的大型经济褐藻,是海洋生态系统重要的初级生产者,也是我国北方沿海主要的养殖藻类。本研究旨在建立海带个体生长数值模型,并以此预测中国北方近海大规模筏式养殖条件下海带的生长情况。本研究以桑沟湾养殖海带为例,利用可视化模型软件STELLA描述海带生长的关键过程及其与环境参数的关系,以净生长量(N_(growth))=总生长量(G_(growth))–呼吸作用(resp)–枯烂(E_(kelp))为基本框架,模拟和预测海带的生物量和叶片长度变化。海带的总生长用光照、温度、盐度、海带体内营养盐(包括N和P)等强制函数定义,其中,光照参数来自桑沟湾气象记录,盐度、温度和营养盐为现场调查实测值。模型模拟桑沟湾养殖海带的长度与干重结果与实测值的拟合度R~2值分别为0.936、0.963,说明该模型能够很好反映海带的真实生长情况。可靠的个体生长模型是评估海带养殖容量的基础,并可为水产养殖区的空间规划提供决策依据。     

真鲷虹彩病毒自然感染杂交石斑鱼“褐龙斑”的组织病理分析

褐龙斑是雌性褐石斑鱼(Epinephelus bruneus)和雄性鞍带石斑鱼(E. lanceolatus)杂交产生的子代。作为杂交石斑鱼的新品种,国内外尚没有褐龙斑疾病的报道。2017年7月,某养殖场褐龙斑出现急性死亡,10 d内累积死亡率高达80%。现场调查发现,病鱼外观无明显异常,但反应迟钝,伏底死亡。临床检查和剖检可见脾和肾严重肿大、易碎。组织病理切片观察发现,各组织中存在数量不等的嗜碱性、细胞质均一、直径为10~15 µm的肿大细胞。超薄组织切片中发现,肿大细胞胞质内存在大量直径为130~150 nm的虹彩病毒样颗粒。使用特异性的PCR引物,从病鱼脾、头肾等组织中均检测到真鲷虹彩病毒(Red seabream iridovirus, RSIV)的高强度感染。测定了该病毒主要衣壳蛋白(Major capsid protein, MCP)基因1362 bp的全长编码区,构建了19种(株)虹彩病毒系统发育树,结果显示,该病毒属于虹彩病毒科肿大细胞病毒属RSIV类群。本研究首次描述了褐龙斑虹彩病毒病的组织病理特征,揭示了褐龙斑是RSIV新的敏感宿主,为杂交石斑鱼病毒病的诊断与防治提供了重要的参考依据。     

中国对虾生物量评估的环境DNA检测技术 的建立及优化

近年来,环境DNA(Environmental DNA, eDNA)技术作为一种新的水生生物调查方法发展迅速,在水生生态系统的研究领域被广泛应用到物种检测、生物多样性评价、生物量评估等方面。然而,很少有研究专门评价e DNA技术操作流程中不同的eDNA富集方法与提取方法对研究结果的影响,从而针对具体研究对象建立一套最佳的eDNA技术操作流程。此外,由于物种间生活习性的差异,不同物种释放到环境中的DNA量及DNA片段大小不同,因而,针对不同研究对象需采用不同的eDNA富集与提取方法。本研究以中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)为研究对象,采用滤膜法富集eDNA,结合血液与组织DNA提取试剂盒提取e DNA。选取直径为47 mm的玻璃纤维膜、硝酸纤维膜、聚碳酸酯膜、尼龙膜共4种材质的滤膜,每种滤膜根据其孔径大小设置0.45、0.8、1.2、5μm共4个梯度,取样水量设置500 ml、1 L、2 L共3个梯度。结果显示,滤膜材质、滤膜孔径大小及取样水体体积均对中国对虾的定性与定量分析具有一定的影响,其中,0.45μm的玻璃纤维滤膜过滤2 L水样能够检测到的DNA拷贝数最多,并依据此建立了一套中国对虾e DNA技术的操作流程,提高了中国对虾的检出率,为后续中国对虾的分布监测及生物量评估提供了基础。     

多目标资源调查站位优化设计——以渤海为例

本研究以渤海为研究区域,通过数值模拟,分析了种类出现率(将基于渤海调查的17个主要渔业种类分为3类:Ⅰ类出现率≥70%,Ⅱ类出现率50%～70%,Ⅲ类出现率50%)和栖息水层对单种类资源量相对误差(Relative error, REE)的影响,不同调查站位数量(48和60)对定点采样与分层随机采样分析结果的影响,并优化了渤海多目标渔业资源调查的设计方案。结果显示,Ⅰ类中5种资源量REE在20%以内,Ⅱ类中3种资源量REE在30%以内,Ⅲ类中6种资源量REE在35%以内,即单种资源量评估值随种类出现率下降,相对误差变大;种类的栖息水层对种类资源量REE无明显影响。定点采样评估值随站位数量减少,精度下降(鱼类、虾类、蟹类、头足类的资源量指数和Margalef丰富度指数的REE分别增加了1.1%、2.5%、8.4%、4.4%和3.3%);分层随机采样可弥补站位数减少带来的精度下降,如站位数为48的分层随机采样获得的鱼类资源量指数评估精度(REE为4.6%)高于站位数为60的定点采样的精度(REE为7.7%),有助于减少调查成本和保护资源量低的种类。然而,每种采样方法并不能完全满足多目标最优,不同站位分配方案影响分层随机采样的精度,按照抽样费用最优准则设置站位,可获得精确度较高的鱼类、虾类、蟹类、头足类及黄鲫(Setipinnataty)、口虾蛄(Oratosquillaoratoria)、日本枪乌贼(Loligojaponica)、鳀鱼(Engraulis japonicus)、叫姑鱼(Johniusgrypotus)、泥脚隆背蟹(Carcinoplaxvestita)、中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)等主要种类资源量评估结果,可作为渤海多目标种类资源调查的站位设计方案。     

凡纳滨对虾商业苗种抗WSSV性能比较

白斑综合征病毒(WSSV)一直是甲壳类生物的高致病性病原。为了解市场上不同凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)商业苗种病原携带情况及其抗WSSV性能,本研究收集了6个品牌的凡纳滨对虾商业苗种(分别简称为海南Z、海南S、广州P、广州Z、黄骅R和东营M),先进行包括WSSV在内的8种病原的检测,然后,采用单尾定量口饲感染方式进行抗WSSV性能测试,并比较各组苗种感染WSSV后的平均存活时间、存活率以及累积死亡率的差异。结果显示,6个商业苗种都不携带WSSV,部分苗种检测有潜在虾肝肠胞虫(EHP)和偷死野田村病毒(CMNV)。各苗种感染WSSV后,平均存活时间从长到短依次为海南Z、广州P、黄骅R、海南S、广州Z、东营M。东营M感染WSSV后第4天达到死亡高峰,而海南Z在第6~7天到达死亡高峰,比东营M晚了2~3d。感染实验结束后,海南Z和广州P存活率最高,同为72.5%,而东营M和黄骅R的存活率最低。本研究表明,海南Z和广州P抗WSSV性能最强,研究结果可为凡纳滨对虾抗病新品种的选育提供基础数据。     

刺参(Apostichopus japonicus)重要经济性状相关SNP标记的验证分析

本研究在前期构建的刺参(Apostichopus japonicus)高密度遗传连锁图谱和QTL分析的基础上,筛选出26个与体长、体重、体宽、棘刺总数、抗病力相关的SNP位点,设计出可用于HRM检测的SNP扩增引物13对。在扩大群体中利用HRM小片段法对这13个刺参重要经济性状相关的候选SNP位点进行分型和多态性检测,并结合扩大群体的相关性状数据进行了QTL位点验证。多态性结果显示,13个位点中有3个单态性位点,其余10个多态性位点中有3个位点为低等位多态性,7个位点为中等位多态性。10个多态性位点的最小等位基因频率(MAF)介于0.016(SNP113)~ 0.332(SNP160)之间,平均值为0.173;各位点的观测杂合度(Ho)介于0.031(SNP113)~0.818(SNP9)之间,平均值为0.433;期望杂合度(He)介于0.031(SNP113)~0.834(SNP9)之间,平均值为0.402;多态信息含量(PIC)介于0.030(SNP113)~0.393(SNP160)之间,平均为0.248,有6个位点偏离Hardy- Weinberg平衡。QTL验证结果表明,SNP40和SNP160位点为与生长(体长、体重、体宽)相关的位点,各位点的优势基因型分别为SNP40(CC)和SNP160(AA);SNP88、SNP112和SNP126这3个位点为与抗病力相关的位点,各位点的优势基因型为SNP88(CC)、SNP112(AA)和SNP126(TT)。基于这5个位点构建生长和抗病二倍型,发现二倍型K1(CC AA TT)抗病力最强,S1(CC AA)、S3(CC AC)在生长方面优势显著,相关研究结果可为分子标记辅助育种在生产中应用提供基础数据。     

不同种类浮游植物对CO2浓度升高的响应

本研究采用实验生态学的方法,以金藻、硅藻、绿藻3个门中的4种常见饵料藻叉鞭金藻(Dicrateria sp.)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、小球藻(Chlorella vulgaris)和亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)为研究对象,分析比较不同浮游植物的细胞数量和质量对CO2浓度升高引起的海水酸化的响应情况。结果显示,与对照组相比,(1) CO2浓度升高显著提高了这4种藻的生长速率(P<0.05);其中,亚心形扁藻平均比生长速率最高,比对照组高出13.5%;小球藻次之,为5.9%;叉鞭金藻和三角褐指藻均为2.2%。(2) CO2浓度升高使浮游植物细胞内的碳(C)含量增加、氮(N)含量降低,C/N提高;种间差异较大,其中,亚心形扁藻的C/N、C/P值、小球藻的C/P值和三角褐指藻的C/N值显著提高,叉鞭金藻不显著。(3) CO2浓度升高使小球藻单位细胞叶绿素a含量显著提高,小球藻通过提高光合作用能力促进生长,而另外3种藻叶绿素a含量与对照组无显著差异;三角褐指藻最大光化学量子产量(Fv/Fm)在实验初期显著升高;叉鞭金藻非光化学淬灭(NPQ)显著降低,快速光曲线初始斜率(α)显著增加;三角褐指藻和亚心形扁藻潜在的最大光合作用能力(rETRmax)显著升高(P<0.05),但CO2浓度升高对4种藻的光化学淬灭(qP)均没有显著影响(P>0.05)。可见,亚心形扁藻、小球藻和三角褐指藻在高CO2浓度下虽然生长速率加快,但营养质量降低。不同种类的浮游植物对CO2浓度升高的响应不同,这种差异可能会使未来海洋浮游植物群落结构发生变化;浮游植物C/N、C/P值的改变可能通过食物链对次级生产者,诸如浮游动物、滤食性贝类等产生影响。